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回答下列问题:
(1)基因编辑载体构建。从 中获取猪的ApoE和LDLR基因序列,设计相应引物,人工合成。将pX458质粒酶切后电泳,加样孔在 极一端,上样缓冲液中需要加入少许 ,它迁移速度较快,在其迁移出凝胶前停止电泳。胶回收产物与引物连接,转化处于 的大肠杆菌,经过筛选、DNA测序确认目标大肠杆菌,将菌液扩增培养,提取质粒备用。
(2)体细胞电转和鉴定。用 擦拭30日龄雌性和雄性猪耳朵消毒,剪取耳组织,眼科剪剪碎,用胰蛋白酶或 等分散耳组织,筛选分散细胞中的成纤维细胞作为初始材料进行 培养。贴壁细胞达到生长基质80%表面面积后,37.5℃,用0.1%胰蛋白酶处理2分钟,加入5倍体积的细胞培养液以 ,制成细胞悬液。将质粒和成纤维细胞置于离心管中,用电击法处理,分选、鉴定、 得到目标成纤维细胞株。
(3)细胞核移植。从屠宰场收集卵巢,人工抽取卵母细胞,在培养液中培养42~44小时至其 ,去除细胞核,将目标成纤维细胞与去核卵细胞进行电融合,电融合可以促进细胞融合,同时还起到 的作用。
(4)胚胎移植。由于 ,胚胎移植成为胚胎工程中获得后代的唯一方法。选择手术移植前一天开始 的母猪作为代孕母体,将发育良好的囊胚植入输卵管,共出生健康的F0代雌性仔猪22头,雄性仔猪10头。
(5)仔猪鉴定、检测和繁育。提取仔猪耳部细胞DNA,PCR扩增目的基因,PCR时预变性时间较长的目的是 ,以利于引物更好的和模板结合。通过凝胶电泳回收扩增产物,测序结果显示32头仔猪均为ApoE和LDLR两基因双敲猪。使用普通饲料饲养克隆猪,产生了明显的AS,这属于 水平的检测。F0代新生仔猪自然交配,F1代仔猪都是ApoE和LDLR两基因双敲猪,表明 ,为医学应用提供理想的实验群体。
4.抗性淀粉是指在小肠中不能被消化吸收但能够作为肠道中某些消化细菌的底物。由于其不能被快速分解,相比与其它淀粉来说具有较低的升糖指数,在饮食上可一定程度的缓解糖尿病。除此之外,抗性淀粉还有降低胰岛素反应、调节肠道功能、能防止脂肪堆积等生理功能,因此其作为一种新型的膳食纤维,正在被广泛追崇。抗性淀粉(RS)的含量与直链淀粉与支链淀粉的含量比成显著相关。可以通过提高直链淀粉的含量来提高 RS 的比例。
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